به منظور تعیین اثرتیمارها بر گاز تولیدی از روش تعیین فشار گاز تولیدی بر اساس بر اساس روش منک ی و استینگاز
( 1988 ( استفاده شد.
تیمارهای آزمایشی به شرح زیر بودند:
1
– شاهد )جیره پایه(
2
– جیره پایه به همراه 03 / 0 درصد مکمل
3
– جیره پایه به همراه 06 / 0 درصد مکمل
اجزا و ترکیب شیمیایی جیرهها در جدول ) 1 ( گزارش شده است. مکمل به صورت سرک به جیره افزوده شد.

نمونه مای ع شکمبه از 3 رأس گاونربالغ نژاد هلشتاین به روش سوند مری و قبل از مصرف وعده غذایی صبح جمعآوری
و صاف گردید. فلاسک محتوی گازکربنیک سریعاً به آزمایشگاه منتقل شد. حیوانات دو بار در روز و با جیره حاوی
4 کیلوگرم یونجه، 3 کیلوگرم سیلاژ ذرت و 5 / 1 کیلوگرم جو خرد شده تغذیه می شدند. پس از صاف نمودن مایع
شکمبه، مایع شکمبه و محیط کشت )محلول ماکرومینرال، محلول میکرومینرال، محلول احیا کننده، محلول بافر و
محلول ریسازورین( به نسبت یک قسمت مایع شکمبه و دو قسمت محیط کشت به داخل بالن سه دهانه مخصوص
ریخته شده و تا زمان انتقال به شیشه های حاوی نمونه در دمای 39 درجه سانتیگراد و در مجاورت گاز دی اکسید
کربن قرار گرفت. برای تهیه مح یط کشت از مایع شکمبه صاف شده با پارچه متقال چهارلا استفاده شد. ترکیب نهایی
محیط کشت ) 500 میلی لیتر( به صورت زیر بود: آب مقطر 237 میلیلیتر، نمکها ی پرنیاز 5 / 118 میلیلیتر، محلول
بافر 5 / 118 میلیلیتر، نمکه ای کم نیاز 06 / 0 میلیلیتر، رزوزارین 61 / 0 ، محلول احیاء کننده 25 میلیلیتر )شامل 8 / 23
میلیلیتر آب مقطر، 1 میلیلیتر سود 1 نرمال و 5 / 142 م یلیگرم سولفید سدیم(. برای اندازهگیری میزان گاز تولیدی،
در ساعات مختلف انکوباسیون نمونههای آزمایشی با آسیاب دارای غربال 1 میلیمتر آسیاب شده و 500 میلیگرم از
نمونههای آسیاب شده در شیشههای مخصوص 100 میلیلیتری ریخته شد. برای هر تیمار 12 شیشه در نظر گرفته
شده بود. و آزمایش دو بار به صورت مجزا در دو روز مختلف که یکبار تا 24 ساعت و یکبار تا 120 ساعت انجام
شد. به هر شیشه 50 میلیلیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت اضافه گشته و درب شیشهها با درپوش پلاستیکی
و پرس فلزی به طور محکم بسته شد و در آون با دمای 39 درجه سانتیگراد قرار داده شده و شیشهها هر 1 ساعت
یکبار تکان داده شد. میزان گازتولیدی درساعات 2 ، 4 ، 8 ، 12 ، 24 ، 48 ، 72 ، 96 ، 120 ساعت و بار دیگر تا 24 ساعت
پس از انکوباسیون قرائت و ثبت شد. به منظورتصحیح گاز تولیدی توسط مایع شکمبه، 3 شیشهی فاقد نمونه )بلانک(
که تنها حاوی 50 میلیلیتر مخلوط مایع شکمبه ومحیط کشت بودند در نظر گرفته شد تا میزان گاز تولید ی آنها ازکل
گاز تولیدی توسط نمونه خوراک کم شده ومقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر نمونه هیدرولیز شده به دست آید. حجم
گاز تولیدی در شیشههای حاوی نمونه مادهی خوراکی در هر زمان توسط رابطه ی V=(Vt-Vb)×100/W تصحیح
گردید. در این رابطه = V حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای هر گرم مادهی خشک، Vt =حجم گاز
تولیدی در شیشههای حاوی نمونهی مادهی خوراکی بر حسب میلی لیتر و = W وزن نمونهی مادهی غذایی بر حسب
میلی گرم مادهی خشک بود. آزمون تولیدگاز در هر آزمون در سه دوره در روزهای مجزا انجام شد و در هردوره
حداقل 3 فلاسک به ازا ی هر تی مار و دراندازهگیریهایی که مستلزم حذف فلاسک پس ازگشودن بود، با سه تکرار به
ازای هر زمان اندازهگیری انجام شد.

تعیین میزان متان تولیدی و فرآ سنجههای شکمبها ی در شیشه های 24 ساعت انکوباسیون
بمنظور تعیین میزان فرآسنجههای مختلف شکمبها ی همانند pH ، جمعیت پروتوزوآ و میزان متان تولیدی در 24 ساعت،
از انکوباسیون مجزا در هنگام انجام آزمون تولید گاز استفاده شد. مقادیر نمونه، محیط کشت و زمان انجام آزمون کاملا
مشابه فرآیند توصیف شده برای آزمون تولید گاز بود. در این آزمون سه فلاسک به ازای هر تیمار 24 ساعت پس از
شروع انکوباسیون بازگشایی شده و پس از اندازهگیری pH با استفاده از دستگاه pH متر )مدل Schott Titrator Titroline easy کشور آلمان(، نمونهی مایع شکمبه برای تعیین جمعیت پروتوزوآ اخ ذ شد. تثب یت پروتوزوآ بهمنظور
شمارش با استفاده از فرمالین 50 درصد تهبه شده با استفاده از سرم فیزی ولوژیک، به نسبت 1:1 با مایع شکمبه انجام
و شمارش پروتوزوآ با استفاده از میکروسکوپ نور ی با بزرگنمایی 40 ، لام مخصوص و رنگ آمیزی متیلن بلو انجام
گرفت ) Dehority, 2005 (. سه فلاسک دیگر 24 ساعت پس از آغاز انکوباسیون بهمنظور تعیین میزان متان تولیدی
مورد استفاده قرار گرفت. از تزریق 4 میلیلیتر محلول 10 مولار سدیم هیدروکسید و قرائت تفاضل گاز قابل
اندازهگیری، پس از گذشت یک دقیقه از تزریق بهمنظور برآورد میزان متان استفاده شد .(Demeyer et al., 1985)
برای اندازهگیری میزان قابلیت هضم ماده خشک نمونههای بعد انکوباسیون داخل شیشهها بلافاصله بعد از باز کردن
درب شیشه ها با استفاده از کاغذ صافی تعیین وزن شده، نمونهها صاف شدند و کاغذ صافی و نمونه ی باقیمانده ی
روی آن در داخل آون قرار داده شد و بعد از خشک شدن در داخل آون کاغذ صافی ونمونه وزن شد و با استفاده از
تفاوت وزن مقدار تجزیه پذیری ماده خشک بدست آمد.
پذیری تجزیه %=( دستگاه از بعد کاغذصافی و نمونه وز ن )−( کاغذ صافی وز ن )
نمونه وز ن
×100
تصحیح برای ذرات موجود از منشاء مایع شکمبه به وسیلهی سه تکرار شیشه ی بلانک استفاده شد و مقدار ذرات
داخل بلانک از مقدار وزن کاغذ و نمونه کم شد و درصد واقعی تجزیهپذیری بدست آمد.